TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS

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  TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS   INTRODUCCION Inmunofluorescencia  Una reacción inmunológica del tipo de unión antígeno- anticuerpo puede ser puesta enevidencia por la emisión de fluorescencia si se utiliza en ella anticuerpos unidos aradicales orgánicos con propiedades fluorescentes y se hace uso de un microscopio defluorescencia para visualizarla.Dicha fluorescencia consiste en la propiedad de ciertas sustancias, denominadasfluorocromos, de emitir luz de mayor longitud de onda de la que reciben mientrasdura la ecitación con la luz incidente. !enta as de la t#cnica -$traordinaria sensibilidad a la comprobación óptica% a la luz com&n, las solucionescromáticas se aprecian coloreadas hasta diluciones de '%'((.(((, sin embargo,lassustancias fluorescentes todavia son suceptibles de determinarse por su fluorescenciaen una dilución de alrededor de '%'.(((.(((. )ermite localizar con precisión el antígenoen concentraciones de '( ugr*ml. -+ápida y sencilla de realizar, ya contando con el equipo es de ba o costo. -e puede utilizar para ubicar antígenos en órganos que poseen mucha contaminacióno virus no viables y que por ende no se pueden multiplicar. -)ueden ser demostrados antígenos intracelulares. Desventa as -$quipo costoso  METODOS  -Directo /D0)rocedimiento original de 1oons y col., se aplica una solución de anticuerposespecíficos marcados con el fluorocromo, sobre la preparación que posee el antígeno.2sí se forma un comple o antígeno-anticuerpo marcado . -ndirecto /03a preparación que contiene el antígeno se enfrenta con el anticuerpo no marcado yeste comple o se visualiza aplicándole antigama-globulina marcada con el fluorocromo.$sta t#cnica se utiliza para identificar y localizar antígenos y para detectar y titularanticuerpos .$s más sensible que el m#todo indirecto pero incrementa la posibilidad de reacciones inespecíficas.Dentro de este m#todo podríamos incluir la tinción del complemento ideada por4old5asser y hepard0 en la que se hace participar al complemento y luego se  visualiza con un suero anticomplemento de cobayo marcado, los autores indican quees más sensible.e utilizó con eito en +abia -1ompetición /10/ue utilizado por 4oldman para tooplasmosis y consiste en mezclar el suero incognitacon el antisuero conocido marcado y esto se enfrenta al antígeno, la disminución de lafluorescencia indica la presencia de anticuerpos en el suero problema que compitieroncon el marcado.  PREPARACION DEL ANTIGENO  '0 $n trozos de te idos cuadro '0 )este )orcina 1lásica ))10% 6azo ,tonsila, linfonódulos mesent#ricos yhepatogástricos, hígado, ri7on y pulmón. )este )orcina 2fricana ))20% idem ))1 +inotraqueitis infecciosa bovina 6+0% te idos fetales ri7on, higado, bazo, pulmón0,mucosa nasal, traqueal, pulmón. !ulvovaginitis-6alanopostitis inf. bov.% hisopados o trozos de mucosa de vulva-vaginao prepucial. $nfermedad de las 8ucosas-Diarrea vírica  6!D!0% 8ucosa intestinal y esofágica,linfonódulos, bazo y m#dula ósea. )arainfluenza-9 )-90%8ucosa nasal y pulmón. a01ortes por congelación e secciona un trozo de órgano del te ido de ''cm y se monta en un taco delmicrótomo, con un congelante o agua.e coloca a congelar a -:(;1 en el micrótomo unto con la cuchilla.e realizan los cortes ))2% <-=u espesor0, ))1% >u, 6+,6!D! y )-9 %?-=u0.e seleccionan los cortes y se adhiren por contacto en un portaob etos limpio ydesengrasado a temperatura ambiente.e rotula y se fi an en acetona a -:(;1 '( min. e secan al aire y se puedencolorear o guardar a -:(;1 en recipientes herm#ticos. b0mprontas e realizan dos toques de la superficie del trozo de te ido con un portaob etolimpio y desengrasado. e rotula y se fi a en acetona a -:(;1 '( min.e secan alaire y se pueden colorear o guardar a -:(;1 en recipientes herm#ticos :0 $n cultivos celulares 2. $n monocapa celular producida en laminillas de tubo 3eigthon o en chambers 3ab@eAB0.$stas monocapas pueden ser de cultivos celulares primarios o de líneas  cuadro 'aislamiento viral0. e inocula el cultivo con el virus o material dediagnóstico.1uando aparace el $1) o al cabo de la incubación <-> días0 se descartael sobrenadante se lavan las laminillas o chambers con )6 y se fi an en acetona a -:(;1 '( min. ecar al aire y guardar en recipiente herm#tico a -:(;1. BCunc cat.'=>EE 6. $n suspesión m#todo del spot o gota0% )reparar una suspensión de c#lulasinfectadas y otra de c#lulas sin infectar. 3avarlas tres veces con )6 . +ealizar el recuento y a ustar las concentraciones de modo tal de obtener unamezcla final que contenga ?>F de c#lulas. sin infectar y 9>F de infectadas y no másde <((.((( c#lulas*ml. 1olocar una gota de la suspensión en cada orificio deportaob etos para fluorescencia. ecar y fi ar en acetona a -:(;1 '( min.ecar al airey guardar en recipiente herm#tico a -:(;1. -)+$)2+21GC D$ 2C@1U$+)G ueros no marcados para el m#todo indirecto detección de 210% e utiliza el suero problema diluido '*> en )6 y en caso de querer titularlo se hacen diluciones en base dos. ueros marcados para el m#todo directo detección de 240%3os fluorocromos más utilizados en la actualidad son%sotiocianato de fluoresceina%estable, se combina con los grupos amino de lasproteínas por uniones carbamido. $s ecitado por la luz azul de <E(nm de long.deonda y emite fluorescencia color verde manzana de >:(nm de long. de onda.sotiocianato de tertametil rodamina% se une a los grupos amino de las proteínaspor grupos tiocarbamidas,es ecitado por luz verde de ><(nm de long. de onda yemite fluorescencia ro a anaran ada de >(nm de long. de onda.e ha comprobado que el o o humano es más sensible al verde que al anaran ado yla autofluorescencia ro a es más com&n, por lo que se usa más el isotiocianato defluoresceina. )rocedimiento de marcado% e precipitan las gamaglobulinas con sulfato de amonio. e centrifugan y lavan con agua destilada. e repiten estos dos pasos. e resuspende el sedimento en buffer tris H1l pHE y se centrifuga. e elimina el sulfato de amonio que pudiera quedar por diálisis o columna deephade 4-:>. e mide la cantidad total de proteínas presentes por 6iuret u otro m#todo. e a7ade el fluorocromo a ba a temperatura y en agitación calculando que debequedar en una relación de gamaglobulina% fluorocromo de '((%'. e elimina el colorante no con ugado en columna de ephade 4-:>. e elimina la fluorescencia inespecífica mediante cromatografía de celulosa. 1omercialmente se pueden adquirir sueros marcados liofilizados o en soluciónconcentrada que se diluye seg&n las instrucciones,no obstante conviene titularlos antesde su uso se deben enfrentar diferentes diluciones del con ugado con el antígeno paraestablecer la mayor dilución en la que se observa me or la fluorescencia0   8$@GDG D+$1@G 8ateriales% .)reparado con el antígeno ya fi ado .6uffer de lavado y diluciónB .1ámara h&meda .+ecipiente de lavado .)ipetas )asteur o micropipetas .1on ugado específico para el antígeno H!6-', 6!D!, ))1 etc0 en la diluciónestablecida por la titulación. .6uffer de montadoB .1ubreob etos B!arian con el con ugado utilizado, seguir las instrucciones que trae. )rocedimiento% .e cubre el preparado con el con ugado en la dilución establecida. .e incuba a 9;1 <> min. en cámara h&meda o toda la noche a <;1 .e lava tres veces con buffer de lavado .e monta con buffer de montado y un cubreob etos .e observa al microscopio de fluorescencia 8$@GDG CD+$1@G -8ateriales.)reparado con el antígeno ya fi ado .6uffer de lavado y diluciónB .1ámara h&meda .+ecipiente de lavado .)ipetas )asteur o micropipetas .2ntisuero específico para el antígeno H!6-', 6!D!, ))1 etc0 en la dilución establecida por la titulación. .6uffer de montadoB .1ubreob etos B!arian con el con ugado utilizado, seguir las instrucciones que trae. . 2nticuerpos problema u específicos diluidos '*> en buffer de dilución.  Inmunoperoi!asa 3a t#cnica permite la inmunodetección de antígenos virales presentes en cultivos celulares como tambi#n en improntas o cortes de te idos de animales infectados.$ste es un m#todo de coloración indirecta en la que se une primero un suero específicopara el antígeno. 3uego una anti-inmunoglobulina de la misma especie a la quecorresponde el primer suero o en su defecto proteína 2 o 4, con ugada con peroidasa./inalmente se coloca un sustrato que da color en presencia de la enzima.$l mecanismo es igual que para / con ciertas venta as%-3a lectura se efect&a en un microscopio com&n de campo claro.
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